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PCR实验前准备事项
日期：2024-04-29 01:31
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摘要：PCR实验前准备事项
在开始PCR实验之前，必须准备好DNA模板（基因组DNA或逆转录制备的cDNA）、特异性引物（自己设计或用软件设计），并选择合适的商业酶（选择符合您实验目的的酶)
1.DNA聚合酶。有许多商业 DNA 聚合酶，它们具有不同的特性。一般分为两类：高保真聚合酶和普通Taq聚合酶。如果您想对没有任何突变的特定 DNA 片段进行 PCR，请选择高保真聚合酶。如果只是想检测特定序列的存在，就选择普通的Taq聚合酶。如果要对T-vector连接的片段进行PCR，要注意，因为大多数高保真聚合酶的产物都没有A-tailing，所以应该选择普通的Taq聚合酶或在PCR实验后添加A-tailing。
2.引物的特异性影响 PCR 成功的概率，良好的引物设计对 PCR 扩增的成功至关重要。当您开始设计引物时，应仔细考虑以下几个原则：
①引物的长度。PCR引物一般在18-22bp左右。这对于引物特异性和在退火温度下的结合来说是足够长的。
②熔化温度(Tm)。Tm 定义为在此温度下，DNA 双链体的一半将解离成单链 DNA。52-58C 范围内的引物 Tm 是合适的。
③GC 含量。合适 GC 含量应为 40-60%。
④许多软件可用于引物设计，例如primer5和Oligo。这些软件推荐的引物通常可以满足我们的需求。