​PCR引物设计基本原则

• 引物长度：18-26bp，可放宽至18-30bp（有研究表明超过30bp再增加引物长度意义不大）；
• 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC*好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列存在；
• 引物Tm：54-58℃，可放宽至52～62℃，GC%>60%可进一步放宽；
• 扩增子Tm：>92℃；
• 3'端：优选三联体WSS、SWS、TTS，二连体GC，单体S，尽量规避WWW、CGW、GGG、CG；
• 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增；
• 末端2bp*好为GC；
• 引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等；
• 其他：避免3'端8bp及以上序列与模板多位点互补，尽量避免上下游3'端4bp及以上反向互补，尽量避免内部回文。

基于上述原则，应用分两种情况：

(1) 基因克隆PCR引物设计

这种情况我们往往并没有太多选择，只能从ATG开始，从TAA等结束，什么GC%、二聚体和错配，可能根本由不得我们。既然起点定了，那只能通过改变长度来匹配*优设计要求了。

(2) 鉴定PCR引物设计

我们只需要确认一段DNA序列上的一部分，起点是相对的，我们可以在整个序列范围内搜索，引物设计的灵活性大大提高，当然搜索时间也要增加。