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PCR检测实验引物退火温度详述

日期:2025-06-10 12:53
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摘要: 退火温度决定PCR特异性与产量;温度高特异性强,但过高则引物不能与模板牢固结合,DNA扩增效率下降;温度低产量高,但过低可造成引物与模板错配,非特异性产物增加。一般先由37℃反应条件开始,设置一系列对照反应,以确定某一特定反应的zui适退火温度。也可根据引物的(G+C)%含量进行推测,把握试验的起始点,一般试验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度TTm(melting temperature)低5℃,可按公式进行计算: Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃   其中A,T,G,C分别表示相应碱基的个数。例如,20个碱基...

    退火温度决定PCR特异性与产量;温度高特异性强,但过高则引物不能与模板牢固结合,DNA扩增效率下降;温度低产量高,但过低可造成引物与模板错配,非特异性产物增加。一般先由37℃反应条件开始,设置一系列对照反应,以确定某一特定反应的zui适退火温度。也可根据引物的(G+C)%含量进行推测,把握试验的起始点,一般试验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度TTm(melting temperature)低5℃,可按公式进行计算: Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃   其中A,T,G,C分别表示相应碱基的个数。例如,20个碱基的引物,如果(G+C)%含量为50%时,则Ta的起点可设在55℃。在典型的引物浓度时(如0.2μmol/L),退火反应数秒即可完成,长时间退火没有必要。