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单层贴壁细胞总蛋白的提取
日期：2025-04-24 04:56
浏览次数：162
摘要：单层贴壁细胞总蛋白的提取：
1.倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2.每瓶细胞加 3 ml 4℃ 预冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动 1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。
3.按 1 ml 裂解液加 10 μ PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）
4.每瓶细胞加 400 μ 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂...
单层贴壁细胞总蛋白的提取：
1.倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2.每瓶细胞加 3 ml 4℃ 预冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动 1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。
3.按 1 ml 裂解液加 10 μ PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）
4.每瓶细胞加 400 μ 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5.裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5 ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）
6.于 4℃ 下 12000rpm 离心 5 min。（提前开离心机预冷）
7.将离心后的上清分装转移倒 1.5 ml 的离心管中放于-20℃ 保存。
（个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶 T-75的细胞有时按照实验要求只能加 100-200μ 的裂解液，按照上述操作，直接用 200μ 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。）
（注：先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，清洗2次，加1ml PBS用细胞刮刮下细胞，转移至1.5 ml 的离心管中，离心得细胞，加裂解液冰上裂解30分钟期间震荡数次，离心，超声裂解，离心，取上清）
1.倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2.每瓶细胞加 3 ml 4℃ 预冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动 1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。
3.按 1 ml 裂解液加 10 μ PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）
4.每瓶细胞加 400 μ 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5.裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5 ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）
6.于 4℃ 下 12000rpm 离心 5 min。（提前开离心机预冷）
7.将离心后的上清分装转移倒 1.5 ml 的离心管中放于-20℃ 保存。
（个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶 T-75的细胞有时按照实验要求只能加 100-200μ 的裂解液，按照上述操作，直接用 200μ 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。）
（注：先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，清洗2次，加1ml PBS用细胞刮刮下细胞，转移至1.5 ml 的离心管中，离心得细胞，加裂解液冰上裂解30分钟期间震荡数次，离心，超声裂解，离心，取上清）