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PCR反应引物设计遵循几条原则
日期：2025-04-24 10:26
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摘要：
引物是决定 PCR 结果的关键，引物设计在 PCR 反应中极为重要。要保证 PCR反应能准确、特异、有效地对模板 DNA 进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：
⑴ 引物的长度以 15-30bp 为宜，一般（G+C）的含量在 45-55%，Tm 值高于 55℃［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现是随机的。
⑵ 引物的 3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在 3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3’端末位碱基在很大程度上影响着 Taq 酶的延伸效率。两条引物间配...
引物是决定 PCR 结果的关键，引物设计在 PCR 反应中极为重要。要保证 PCR反应能准确、特异、有效地对模板 DNA 进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：
⑴ 引物的长度以 15-30bp 为宜，一般（G+C）的含量在 45-55%，Tm 值高于 55℃［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现是随机的。
⑵ 引物的 3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在 3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3’端末位碱基在很大程度上影响着 Taq 酶的延伸效率。两条引物间配对碱基数少于 5 个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过 3 个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。
⑶ 人工合成的寡聚核苷酸引物需经 PAGE 或离子交换 HPLC 进行纯化。
⑷ 引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用 0.25-0.5pM/μl 较好。
⑸ 引物一般用 TE 配制成较高浓度的母液（约 100μM），保存于-20℃。使用前取出其中
一部分用 ddH2O 配制成 10μM 或 20μM 的工作液。