PCR实验循环步骤方法

根据PCR使用说明进行试剂混合预配，并设置 PCR 循环。简而言之，PCR实验循环步骤方法如下：

1. 初始化步骤

这仅对热启动 PCR 必不可少。此步骤将溶液加热至 94-98°C，以激活 DNA 聚合酶。该步骤的时间取决于所使用的聚合酶。

2. 变性步骤

DNA是双链分子，DNA扩增需要引物与单链DNA模板相互作用。在此步骤中，将反应混合物加热至 94-98°C 并保持 20-30 秒，以破坏两条链之间的氢键并**单链 DNA 分子。此时进入 PCR 循环。

3. 退火步骤

变性后，反应混合物中的 DNA 模板是单链的。由于引物与DNA模板互补，当反应温度降低到50-65℃时，引物会与模板序列匹配，互补碱基之间形成氢键。退火温度取决于所用引物的Tm，一般比引物Tm低3-5℃左右。该步骤将持续约 20-40 秒以完全退火，然后聚合酶将定位到引物-模板杂交体以开始 DNA 组装。

4. 伸长步骤

在此步骤中，DNA 聚合酶开始合成 DNA，因此温度应为 DNA 聚合酶的合适温度。一般选择 72°C，但有些酶在 68°C 时效果更好。这一步与体内DNA复制非常相似，DNA聚合酶将dNTPs添加到引物中，以5'到3'方向与模板互补，后面产生新的双链DNA片段。延伸时间取决于目标 DNA 片段的长度和 DNA 聚合酶的能力。一般来说，DNA 聚合酶每 60 秒产生一千个碱基。5. 2~4步称为一个循环，每循环一次，目标片段量翻倍。一个 PCR 过程使用 30-35 个循环。在 PCR 循环的早期，PCR 产物以指数速率积累，而在 PCR 循环的后期，随着 dNTPs、引物的减少和 DNA 聚合酶在变性温度下的失活，反应减慢，PCR 速率逐渐下降。6.后面伸长率。30-35个循环结束后，在68-74℃的温度下后面延伸约5-10分钟，以充分延伸剩余的单链DNA。7.贮存。后面产品可以在 PCR 机器中维持温度在 4-10°C。